Path: Top > S3-Dissertations > Mathematics-FMIPA > 2000

PROTEIN YANG TERKAIT DENGAN PATOGENESIS DARI HEVEA BRASILIENSIS MUELL ARG (ISOLASI, STRUKTUR DAN FUNGSI)

PhD Theses from JBPTITBPP / 2017-09-27 15:45:34
Oleh : TOTO SUBROTO, S3 - Mathematics and Natural Sciences
Dibuat : 2000-06-24, dengan file

Keyword :

Abstrak:

Indonesia merupakan negara pengekspor karet alam terbesar di dunia setelah Thailand. Peningkatan kualitas tanaman karet (Hevea brasiliensis) secara konvensional terus dilakukan melalui pencarian bibit unggul. Namun demikian, peningkatan produksi karet alam seringkali dihambat oleh adanya serangan hama terutama fungi patogen. Untuk pengendalian fungi patogen pada umumnya digunakan fungisida sintetik, namun cara ini seringkali menimbulkan dampak negatif terhadap lingkungan dan harganya relatif mahal. Dengan demikian alternatif lain diperlukan untuk pengendalian penyakit yang lebih efisien serta aman terhadap lingkungan.

Konsep baru pengendalian penyakit tanaman, adalah melalui transfer gen resisten ke dalam genom sate spesies tanaman maupun spesies lain. Untuk mengidentifikasi dan mengisolasi gen resisten, diperlukan informasi struktur primer parsial proteinnya yang kemudian digunakan untuk merancang oligonukleotida yang komplemen dengan bagian deret gen yang mengkode protein tersebut. Dengan demikian, informasi struktur primer protein spesifik yang berperan dalam resistensi tanaman, sangatlah esensial untuk mengisolasi dan mengidentifikasi gen resisten tersebut, selain itu protein alami diperlukan untuk pengujian aktivitas biologisnya serta mengetahui proses yang terjadi selama modifikasi pascatranslasinya.

Informasi mengenai protein yang berperan dalam pertahanan H. brasiliensis, terlebih lagi pada klon H. brasiliensis yang resisten belum banyak diketahui. Penelitian protein yang berperan dalam pertahanan tanaman, mengungkapkan bahwa tanaman mensintesis protein-PR (pathogenesis-related protein) ketika tanaman diinfeksi oleh patogen. Fungsi protein-PR antara lain sebagai kitinase dan β-1,3- glukanase, kedua enzim ini mampu mengkatalisis hidrolisis polisakarida yang merupakan komponen utama dinding sel fungi.

Dengan demikian kemungkinan besar kedua enzim tersebut berperan dalam pertahanan tanaman terhadap serangan fungi patogen. Kenyataan ini didukung oleh tidak ditemukannya kitin pada tanaman tinggi, juga kedua enzim ini dapat mendegradasi isolat dinding sel fungi dan telah ditunjukkan menghambat pertumbuhan fungi in vitro dan bahkan uji in vivo pada tanaman transgenik protein-PR dapat meningkatkan resistensi tanaman terhadap fungi patogen.

Penelitian ini bertujuan untuk:

  1. mengisolasi dan mengidentifikasi protein utama dalam organel lutoid lateks H. brasiliensis,
  2. mengkarakterisasi struktur primer proteinnya, untuk mencari homologi dengan protein-PR yang telah diketahui fungsinya,
  3. mempelajari sifat-sifat enzimatik protein tersebut. Di samping itu, untuk mengetahui peranan protein-PR pada klon H. brasifensis yang resisten, maka sebagai studi perbandingan digunakan klonPR261 dan RRIM 600 (resisten) serta klon GT1 (rentan) dan satu klon LCB1320 (primer).

Untuk mengungkap adanya protein-PR, protein utama dalam organel-lutoid lateks segar diisolasi dan dimurnikan dengan cara: sentrifugasi, pemecahan membran organel lutoid, presipitasi protein dengan amonium sulfat, diikuti fraksionasi dengan kromatografi kolom: filtrasi gel, penukar kation dan anion, serta HPLC fasa terbalik. Sementara itu kemurnian sampel protein diamati secara ektroforesis gel SDS poliakrilamida (SDS-PAGE) menurut metode Laemmli.

Protein murni diidentifikasi dengan cara menentukan deret ujung-N-nya dengan metode degradasi Edman melalui penentu deret, atau peptida internalnya setelah proteinnya dipotong dengan CNBr atau enzim tripsin, kemudian individu peptida dipisahkan dengan HPLC fasa terbalik. Selanjutnya isolat peptidanya dipelajari secara spektrometri massa ESMS atau MALDI TOF.

Fungsi protein hasil pemurnian dari organel-lutoid lateks dapat diprediksi, dengan cara membandingkan struktur primer parsialnya dengan protein yang telah diketahui fungsinya dari bank data. Aktivitas kitinase dari protein murni ditentukan menurut metode Melchers, sedangkan β-1,3-glukanasenya menurut metode Kauffmann. Sementara itu uji aktivitas biologis protein murni diteliti dengan uji inhibisi terhadap pertumbuhan fungi menurut metode Woloshuk.

Lima komponen protein utama dalam organel-lutoid lateks H. brasiliensis dapat diidentifikasi secara SDS-PAGE, yaitu protein berbobot molekul: 5 kDa (hevein), 14 kDa, 19 kDa, 29 kDa (hevamin) dan 35 kDa, sedangkan protein 25 kDa dan 43 kDa merupakan komponen minornya.

Protein 19 kDa dan 14 kDa dapat diisolasi dan dimurnikan secara simultan dengan kromatografi kolom karboksimetilselulosa gradien linier konsentrasi bufer borat yang meningkat pada pH 8,9. Dari kajian lebih lanjut oleh Soedjanaatmadja menunjukkan bahwa protein 14 kDa merupakan ujung-N dari prohevein, sedangkan protein 19 kDa adalah prohevein. Selain ditemukan kedua komponen hevamin A dan B, juga ditemukan isoform hevamin ketiga yang disebut sebagai hevamin X, dan terelusi dari kolom sebelum hevamin A dan B dengan kekuatan ion 600 µMhos, sementara itu hevamin A dan B berturut- turut pada 1100 µMhos dan 1500 µMhos. Penentuan deret asam amino ujung-N hevamin X, menunjukkan deret yang identik dengan hevamin A dan B, yaitu Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-, namun titik isoelektriknya (9,3), yang berbeda dengan hevamin A (9,9) dan B (10,5).

Untuk menelusuri perbedaan antara hevamin X dan hevamin A pada taraf asam amino, ditentukan sidik jari (fingerprint) peptida hasil pemotongan hevamin X dan A dalam kondisi identik dengan enzim tripsin dan diteliti dengan HPLC fasa terbalik, kemudian diikuti penentuan massa isolat peptidanya secara spektrometri massa. Hasilnya menunjukkan bahwa pola peptida dari hevamin X dan A adalah identik dan semua peptida yang diperkirakan dapat diidentifikasi dengan spektrometri massa.

Dengan demikian perbedaan hevamin X dan A pada taraf asam amino tidak ditemukan. Kemungkinan besar perbedaan kedua komponen disebabkan adanya pergantian Asp atau Glu dengan Asn atau Gln, sebagai hasil mutasi alami atau deaminasi yang spesifik. Keadaan ini akan menghasilkan perbedaan titik isoelektrik tetapi masssanya hampir sama, oleh karena itu perbedaannya tidak akan terdeteksi dengan spektrometri massa.

Deret cDNA hevamin yang ditentukan Bokma menunjukkan bahwa hevamin di sintesis dengan deret signal ujung-N, yang mengarahkan protein baru terbentuk ini ke retikulum endoplasma untuk dieksresikan. Kenyataan ini tampak dari perbandingan deret ujung-N hevamin hasil analisis (huruf tebal) dengan deret deduksi dari cDNA yaitu, -Met-Ser-Ser-Ser-His-Val-Asp-Gly-↓Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-, dimana deret signal (sebelum tanda ↓) tidak tampak lagi pada hevamin matang hasil isolasi dari organel-lutoid.

Inkubasi hevamin dengan kitin sebagai substrat menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin memiliki aktivitas spesifik kitinase yang sama. Namun inkubasi dengan substrat dinding sel hasil preparasi dari Micrococcus lysodeikticus, menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin memiliki aktivitas spesifik lisozim yang berbeda. Aktivitas lisozim dari hevamin memiliki pH optimum yang sangat tajam (pH 4,9), sedangkan pH optimum kitinase sangat melebar pada kisaran pH 4 hingga lebih tinggi pH 6. Aktivitas lisozim hanya dapat diamati pada konsentrasi garam yang rendah, sedangkan aktivitas kitinase tidak banyak dipengaruhi oleh konsentrasi garam.

Protein 35 kDa telah dimurnikan dengan kromatografi kolom karboksimetil-selulosa gradien linier konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer NaOAc pada pH 5,2. Analisis deret asam amino protein ini menunjukkan ujung-N terebat. Setelah protein dipotong dengan CNBr dan dipisahkan dengan HPLC fasa terbalik diperoleh suatu campuran peptida yang mengandung komponen utama dan minor. Pencarian homologi dengan deret protein dari bank data menunjukkan bahwa peptida utama dan minor adalah homolog dengan bagian ujung-C dan ujung-N deret yang dideduksi dari cDNA β-1,3-glukanase H.brasiliensis, yang juga homolog dengan deret protein PR -2 (β-1,3-glukanase) dari tanaman lain.

Hasil analisis deret dan spektrometri massa ESMS, diperoleh suatu informasi bahwa protein 35 kDa adalah protein dengan bagian ujung-C yang tidak utuh, adanya komponen utama yang mengandung ujung-C glisina, tetapi ada juga yang mengandung ujung-C alanina serta alanina-glutamat yaitu: -Asn-Leu-Asn-Phe-Gly-Ala-Glu dengan perbandingan 6:1:1. Selain itu, perbandingan deret asam amino bagian ujung-C protein 35 kDa dengan deret yang dideduksi dari cDNA (-Asn-Leu-Asn-Phe-Gly-Ala-Glu-Lys-Asn-Trp-Asp-Ile-Ser-Thr-Glu-His-), menunjukkan bahwa protein ini merupakan protein organel-lutoid lateks. Kenyataan ini tampak di muka, pada deret asam amino ujung-C dari cDNA masih ditemukan adanya ekstra peptida (huruf tebal) yang mengarahkan protein ini menuju ke organel target yaitu organel-lutoid (C-terminal lutoid targeting signal).

Penentuan sifat enzimatik protein 35 kDa melalui inkubasi dengan oligo β-1,3-glukan sebagai substrat menunjukkan bahwa protein 35 kDa memiliki aktivitas glukanase. Pengujian aktivitas biologisnya in vitro, menunjukkan bahwa tidak hanya hevamin tetapi juga protein 35 kDa memiliki aktivitas antifungal. Sementara itu analisis kandungan protein 35 kDa dan hevamin pada lutoid lateks H. brasiliensis yang terinfeksi fungi patogen menunjukkan bahwa kedua protein disintesis sebesar 1,5 dan 3 kali lebih tinggi dibandingkan dengan yang berasal dari lutoid lateks H. brasiliensis yang sehat.

Dengan ini dapat dinyatakan bahwa hevamin dan protein 35 kDa berperan dalam pertahanan H. brasiliensis terhadap serangan patogen.

Di samping berfungsi sebagai protein-PR, protein 35 kDa dan hevamin sebagai protein basa (bermuatan positif) juga berpengaruh terhadap kestabilan suspensi partikel karet. Kedua protein ini dapat mendestabilkan suspensi partikel karet yang bermuatan negatif. Namun, pengaruh destabilisasi protein 35 kDa lebih kuat dibandingkan dengan hevamin. Pada kondisi 25 μg per mL suspensi partikel karet, protein 35 kDa mampu menyebabkan proses creaming partikel karet, sedangkan untuk efek tersebut hevamin diperlukan sebanyak 120 µg per mL.

Protein 25 kDa telah dimurnikan dari organel lutoid lateks klon PR261 setelah presipitasi dengan amonium sulfat pada kejenuhan 50-100%, kemudian kromatografi kolom karboksimetilselulosa dengan gradien linier konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer Tris-HCl pada pH 8, dikuti dengan HPLC fasa terbalik elusi gradien linier asetonitril 0-70% dalam 0,1% TFA dengan kolom nukleosil C18. Sementara itu protein anionik 43 kDa telah dimurnikan dengan kolom penukar anion dietilaminoetil dengan gradien konsentrasi linier NaCl yang meningkat dalam bufer Tris HCI, pH 8, dan dilanjutkan rekromatografi dengan kolom filtrasi gel Sephadex G 75.

Analisis deret parsial ujung-N protein 25 kDa dan peptida CNBr protein menunjukkan homologi dengan protein antifungal mirip-taumatin yang berasal dari Nicotinia tabacum, juga homolog dengan deret protein PR-5 dari tanaman lain. Analisis deret ujung-N protein 43 kDa menunjukkan ujung-N terebat. Setelah dipotong dengan CNBr dan dipisahkan HPLC fasa terbalik diperoleh peptida campuran. Deret ujung-N suatu peptida CNBr pendek internal menunjukkan homologi dengan patatin, suatu protein yang memiliki aktivitas palmitat asilase dari Solanum tuberosum, dan identik dengan alerge lateks hev b 7, suatu protein yang diisolasi dari C-serum (sitoplasma) lateks karet.

Sebagai tambahan pada protein 25 kDa mirip-taumatin, ditemukan protein lain dengan bobot molekul yang sama telah diisolasi dari organel-lutoid dengan menggunakan prosedur yang sama untuk isolasi protein 25 kDa mirip-taumatin. Analisis deret dan spektrometri massa peptida CNBr yang diperoleh dari protein ini menunjukkan keidentikan dengan protein pengikat-sitrat dari lateks H. brasiliensis, yang telah ditenukan deret cDNA-nya oleh Rentsch. Demikian juga deret signal ujung-N dan ujung-C tidak ditemukan lagi pada protein 25 kDa matang.

Dari kajian perbandingan klon H. brasiliensis yang diteliti ditemukan adanya perbedaan: protein 25 kDa mirip-taumatin antifungal hanya ditemukan pada klon PR261 yang resisten fungi dan tidak ditemukan pada klon yang rentan (GT1). Ditemukan pula perbedaan β-1,3-glukanase diantara klon PR261 dan GT1. Bobot molekul enzim ini pada klon GT1 lebih tinggi, kemungkinan besar disebabkan oleh glikosilasi. Pada ujung-C peptida CNBr ditemukan tiga deret asam amino yang berbeda diantara glukanase dari klon PR261 dan GT1, yaitu pada posisi 306 (Asn), dan 316 (Ser). Demikian juga aktivitas spesifik β-1,3-glukanase dari kedua klon berbeda, aktivitas spesifik dari klon GT1 tiga kali lebih rendah dibandingkan kion PR261.

Deskripsi Alternatif :

Abstrak:

Indonesia merupakan negara pengekspor karet alam terbesar di dunia setelah Thailand. Peningkatan kualitas tanaman karet (Hevea brasiliensis) secara konvensional terus dilakukan melalui pencarian bibit unggul. Namun demikian, peningkatan produksi karet alam seringkali dihambat oleh adanya serangan hama terutama fungi patogen. Untuk pengendalian fungi patogen pada umumnya digunakan fungisida sintetik, namun cara ini seringkali menimbulkan dampak negatif terhadap lingkungan dan harganya relatif mahal. Dengan demikian alternatif lain diperlukan untuk pengendalian penyakit yang lebih efisien serta aman terhadap lingkungan.

Konsep baru pengendalian penyakit tanaman, adalah melalui transfer gen resisten ke dalam genom sate spesies tanaman maupun spesies lain. Untuk mengidentifikasi dan mengisolasi gen resisten, diperlukan informasi struktur primer parsial proteinnya yang kemudian digunakan untuk merancang oligonukleotida yang komplemen dengan bagian deret gen yang mengkode protein tersebut. Dengan demikian, informasi struktur primer protein spesifik yang berperan dalam resistensi tanaman, sangatlah esensial untuk mengisolasi dan mengidentifikasi gen resisten tersebut, selain itu protein alami diperlukan untuk pengujian aktivitas biologisnya serta mengetahui proses yang terjadi selama modifikasi pascatranslasinya.

Informasi mengenai protein yang berperan dalam pertahanan H. brasiliensis, terlebih lagi pada klon H. brasiliensis yang resisten belum banyak diketahui. Penelitian protein yang berperan dalam pertahanan tanaman, mengungkapkan bahwa tanaman mensintesis protein-PR (pathogenesis-related protein) ketika tanaman diinfeksi oleh patogen. Fungsi protein-PR antara lain sebagai kitinase dan β-1,3- glukanase, kedua enzim ini mampu mengkatalisis hidrolisis polisakarida yang merupakan komponen utama dinding sel fungi.

Dengan demikian kemungkinan besar kedua enzim tersebut berperan dalam pertahanan tanaman terhadap serangan fungi patogen. Kenyataan ini didukung oleh tidak ditemukannya kitin pada tanaman tinggi, juga kedua enzim ini dapat mendegradasi isolat dinding sel fungi dan telah ditunjukkan menghambat pertumbuhan fungi in vitro dan bahkan uji in vivo pada tanaman transgenik protein-PR dapat meningkatkan resistensi tanaman terhadap fungi patogen.

Penelitian ini bertujuan untuk:

  1. mengisolasi dan mengidentifikasi protein utama dalam organel lutoid lateks H. brasiliensis,
  2. mengkarakterisasi struktur primer proteinnya, untuk mencari homologi dengan protein-PR yang telah diketahui fungsinya,
  3. mempelajari sifat-sifat enzimatik protein tersebut. Di samping itu, untuk mengetahui peranan protein-PR pada klon H. brasifensis yang resisten, maka sebagai studi perbandingan digunakan klonPR261 dan RRIM 600 (resisten) serta klon GT1 (rentan) dan satu klon LCB1320 (primer).

Untuk mengungkap adanya protein-PR, protein utama dalam organel-lutoid lateks segar diisolasi dan dimurnikan dengan cara: sentrifugasi, pemecahan membran organel lutoid, presipitasi protein dengan amonium sulfat, diikuti fraksionasi dengan kromatografi kolom: filtrasi gel, penukar kation dan anion, serta HPLC fasa terbalik. Sementara itu kemurnian sampel protein diamati secara ektroforesis gel SDS poliakrilamida (SDS-PAGE) menurut metode Laemmli.

Protein murni diidentifikasi dengan cara menentukan deret ujung-N-nya dengan metode degradasi Edman melalui penentu deret, atau peptida internalnya setelah proteinnya dipotong dengan CNBr atau enzim tripsin, kemudian individu peptida dipisahkan dengan HPLC fasa terbalik. Selanjutnya isolat peptidanya dipelajari secara spektrometri massa ESMS atau MALDI TOF.

Fungsi protein hasil pemurnian dari organel-lutoid lateks dapat diprediksi, dengan cara membandingkan struktur primer parsialnya dengan protein yang telah diketahui fungsinya dari bank data. Aktivitas kitinase dari protein murni ditentukan menurut metode Melchers, sedangkan β-1,3-glukanasenya menurut metode Kauffmann. Sementara itu uji aktivitas biologis protein murni diteliti dengan uji inhibisi terhadap pertumbuhan fungi menurut metode Woloshuk.

Lima komponen protein utama dalam organel-lutoid lateks H. brasiliensis dapat diidentifikasi secara SDS-PAGE, yaitu protein berbobot molekul: 5 kDa (hevein), 14 kDa, 19 kDa, 29 kDa (hevamin) dan 35 kDa, sedangkan protein 25 kDa dan 43 kDa merupakan komponen minornya.

Protein 19 kDa dan 14 kDa dapat diisolasi dan dimurnikan secara simultan dengan kromatografi kolom karboksimetilselulosa gradien linier konsentrasi bufer borat yang meningkat pada pH 8,9. Dari kajian lebih lanjut oleh Soedjanaatmadja menunjukkan bahwa protein 14 kDa merupakan ujung-N dari prohevein, sedangkan protein 19 kDa adalah prohevein. Selain ditemukan kedua komponen hevamin A dan B, juga ditemukan isoform hevamin ketiga yang disebut sebagai hevamin X, dan terelusi dari kolom sebelum hevamin A dan B dengan kekuatan ion 600 µMhos, sementara itu hevamin A dan B berturut- turut pada 1100 µMhos dan 1500 µMhos. Penentuan deret asam amino ujung-N hevamin X, menunjukkan deret yang identik dengan hevamin A dan B, yaitu Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-, namun titik isoelektriknya (9,3), yang berbeda dengan hevamin A (9,9) dan B (10,5).

Untuk menelusuri perbedaan antara hevamin X dan hevamin A pada taraf asam amino, ditentukan sidik jari (fingerprint) peptida hasil pemotongan hevamin X dan A dalam kondisi identik dengan enzim tripsin dan diteliti dengan HPLC fasa terbalik, kemudian diikuti penentuan massa isolat peptidanya secara spektrometri massa. Hasilnya menunjukkan bahwa pola peptida dari hevamin X dan A adalah identik dan semua peptida yang diperkirakan dapat diidentifikasi dengan spektrometri massa.

Dengan demikian perbedaan hevamin X dan A pada taraf asam amino tidak ditemukan. Kemungkinan besar perbedaan kedua komponen disebabkan adanya pergantian Asp atau Glu dengan Asn atau Gln, sebagai hasil mutasi alami atau deaminasi yang spesifik. Keadaan ini akan menghasilkan perbedaan titik isoelektrik tetapi masssanya hampir sama, oleh karena itu perbedaannya tidak akan terdeteksi dengan spektrometri massa.

Deret cDNA hevamin yang ditentukan Bokma menunjukkan bahwa hevamin di sintesis dengan deret signal ujung-N, yang mengarahkan protein baru terbentuk ini ke retikulum endoplasma untuk dieksresikan. Kenyataan ini tampak dari perbandingan deret ujung-N hevamin hasil analisis (huruf tebal) dengan deret deduksi dari cDNA yaitu, -Met-Ser-Ser-Ser-His-Val-Asp-Gly-↓Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-, dimana deret signal (sebelum tanda ↓) tidak tampak lagi pada hevamin matang hasil isolasi dari organel-lutoid.

Inkubasi hevamin dengan kitin sebagai substrat menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin memiliki aktivitas spesifik kitinase yang sama. Namun inkubasi dengan substrat dinding sel hasil preparasi dari Micrococcus lysodeikticus, menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin memiliki aktivitas spesifik lisozim yang berbeda. Aktivitas lisozim dari hevamin memiliki pH optimum yang sangat tajam (pH 4,9), sedangkan pH optimum kitinase sangat melebar pada kisaran pH 4 hingga lebih tinggi pH 6. Aktivitas lisozim hanya dapat diamati pada konsentrasi garam yang rendah, sedangkan aktivitas kitinase tidak banyak dipengaruhi oleh konsentrasi garam.

Protein 35 kDa telah dimurnikan dengan kromatografi kolom karboksimetil-selulosa gradien linier konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer NaOAc pada pH 5,2. Analisis deret asam amino protein ini menunjukkan ujung-N terebat. Setelah protein dipotong dengan CNBr dan dipisahkan dengan HPLC fasa terbalik diperoleh suatu campuran peptida yang mengandung komponen utama dan minor. Pencarian homologi dengan deret protein dari bank data menunjukkan bahwa peptida utama dan minor adalah homolog dengan bagian ujung-C dan ujung-N deret yang dideduksi dari cDNA β-1,3-glukanase H.brasiliensis, yang juga homolog dengan deret protein PR -2 (β-1,3-glukanase) dari tanaman lain.

Hasil analisis deret dan spektrometri massa ESMS, diperoleh suatu informasi bahwa protein 35 kDa adalah protein dengan bagian ujung-C yang tidak utuh, adanya komponen utama yang mengandung ujung-C glisina, tetapi ada juga yang mengandung ujung-C alanina serta alanina-glutamat yaitu: -Asn-Leu-Asn-Phe-Gly-Ala-Glu dengan perbandingan 6:1:1. Selain itu, perbandingan deret asam amino bagian ujung-C protein 35 kDa dengan deret yang dideduksi dari cDNA (-Asn-Leu-Asn-Phe-Gly-Ala-Glu-Lys-Asn-Trp-Asp-Ile-Ser-Thr-Glu-His-), menunjukkan bahwa protein ini merupakan protein organel-lutoid lateks. Kenyataan ini tampak di muka, pada deret asam amino ujung-C dari cDNA masih ditemukan adanya ekstra peptida (huruf tebal) yang mengarahkan protein ini menuju ke organel target yaitu organel-lutoid (C-terminal lutoid targeting signal).

Penentuan sifat enzimatik protein 35 kDa melalui inkubasi dengan oligo β-1,3-glukan sebagai substrat menunjukkan bahwa protein 35 kDa memiliki aktivitas glukanase. Pengujian aktivitas biologisnya in vitro, menunjukkan bahwa tidak hanya hevamin tetapi juga protein 35 kDa memiliki aktivitas antifungal. Sementara itu analisis kandungan protein 35 kDa dan hevamin pada lutoid lateks H. brasiliensis yang terinfeksi fungi patogen menunjukkan bahwa kedua protein disintesis sebesar 1,5 dan 3 kali lebih tinggi dibandingkan dengan yang berasal dari lutoid lateks H. brasiliensis yang sehat.

Dengan ini dapat dinyatakan bahwa hevamin dan protein 35 kDa berperan dalam pertahanan H. brasiliensis terhadap serangan patogen.

Di samping berfungsi sebagai protein-PR, protein 35 kDa dan hevamin sebagai protein basa (bermuatan positif) juga berpengaruh terhadap kestabilan suspensi partikel karet. Kedua protein ini dapat mendestabilkan suspensi partikel karet yang bermuatan negatif. Namun, pengaruh destabilisasi protein 35 kDa lebih kuat dibandingkan dengan hevamin. Pada kondisi 25 μg per mL suspensi partikel karet, protein 35 kDa mampu menyebabkan proses creaming partikel karet, sedangkan untuk efek tersebut hevamin diperlukan sebanyak 120 µg per mL.

Protein 25 kDa telah dimurnikan dari organel lutoid lateks klon PR261 setelah presipitasi dengan amonium sulfat pada kejenuhan 50-100%, kemudian kromatografi kolom karboksimetilselulosa dengan gradien linier konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer Tris-HCl pada pH 8, dikuti dengan HPLC fasa terbalik elusi gradien linier asetonitril 0-70% dalam 0,1% TFA dengan kolom nukleosil C18. Sementara itu protein anionik 43 kDa telah dimurnikan dengan kolom penukar anion dietilaminoetil dengan gradien konsentrasi linier NaCl yang meningkat dalam bufer Tris HCI, pH 8, dan dilanjutkan rekromatografi dengan kolom filtrasi gel Sephadex G 75.

Analisis deret parsial ujung-N protein 25 kDa dan peptida CNBr protein menunjukkan homologi dengan protein antifungal mirip-taumatin yang berasal dari Nicotinia tabacum, juga homolog dengan deret protein PR-5 dari tanaman lain. Analisis deret ujung-N protein 43 kDa menunjukkan ujung-N terebat. Setelah dipotong dengan CNBr dan dipisahkan HPLC fasa terbalik diperoleh peptida campuran. Deret ujung-N suatu peptida CNBr pendek internal menunjukkan homologi dengan patatin, suatu protein yang memiliki aktivitas palmitat asilase dari Solanum tuberosum, dan identik dengan alerge lateks hev b 7, suatu protein yang diisolasi dari C-serum (sitoplasma) lateks karet.

Sebagai tambahan pada protein 25 kDa mirip-taumatin, ditemukan protein lain dengan bobot molekul yang sama telah diisolasi dari organel-lutoid dengan menggunakan prosedur yang sama untuk isolasi protein 25 kDa mirip-taumatin. Analisis deret dan spektrometri massa peptida CNBr yang diperoleh dari protein ini menunjukkan keidentikan dengan protein pengikat-sitrat dari lateks H. brasiliensis, yang telah ditenukan deret cDNA-nya oleh Rentsch. Demikian juga deret signal ujung-N dan ujung-C tidak ditemukan lagi pada protein 25 kDa matang.

Dari kajian perbandingan klon H. brasiliensis yang diteliti ditemukan adanya perbedaan: protein 25 kDa mirip-taumatin antifungal hanya ditemukan pada klon PR261 yang resisten fungi dan tidak ditemukan pada klon yang rentan (GT1). Ditemukan pula perbedaan β-1,3-glukanase diantara klon PR261 dan GT1. Bobot molekul enzim ini pada klon GT1 lebih tinggi, kemungkinan besar disebabkan oleh glikosilasi. Pada ujung-C peptida CNBr ditemukan tiga deret asam amino yang berbeda diantara glukanase dari klon PR261 dan GT1, yaitu pada posisi 306 (Asn), dan 316 (Ser). Demikian juga aktivitas spesifik β-1,3-glukanase dari kedua klon berbeda, aktivitas spesifik dari klon GT1 tiga kali lebih rendah dibandingkan kion PR261.

Beri Komentar ?#(0) | Bookmark

PropertiNilai Properti
ID PublisherJBPTITBPP
OrganisasiS
Nama KontakUPT Perpustakaan ITB
AlamatJl. Ganesha 10
KotaBandung
DaerahJawa Barat
NegaraIndonesia
Telepon62-22-2509118, 2500089
Fax62-22-2500089
E-mail Administratordigilib@lib.itb.ac.id
E-mail CKOinfo@lib.itb.ac.id

Print ...

Kontributor...

  • Promotor 1
    Soekeni Soedigdo, Prof.Dr.Hj.

    Promotor 2
    J.J. Beintema, Prof.Dr.

    Promotor 3
    Purwo Arbianto, Dr.

    Scan:
    kris@pps.itb.ac.id
    (2001-12-26)

    Editor:
    Ena Sukmana, S.Sos.
    (2006-03-06), Editor: