Path: TopS3-DissertationsChemistry-FMIPA2015

STRUKTUR DAN FUNGSI POLIKETIDA SINTASE (PKS18) DARI Mycobacterium tuberculosis

STRUCTURE AND FUNCTION of POLYKETIDE SYNTHASE (PKS18) from Mycobacterium tuberculosis

PhD Theses from JBPTITBPP / 2017-11-22 15:24:43
Oleh : RINA BUDI SATIYARTI (NIM : 30510008), S3 - Chemistry-FMIPA
Dibuat : 2015, dengan 6 file

Keyword : Dinding sel, Mycobacterium tuberculosis, clinical isolates, pks18, PKS18, α-piron.

Poliketida adalah metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman, hewan, jamur, dan bakteri. Poliketida merupakan hasil reaksi penggabungan rantai karbon kelipatan C2 yang berasal dari asam lemak. α-Piron adalah contoh poliketida yang terdapat pada lapisan lipid dan glikolipid dinding sel Mycobactrium tuberculosis. Biosintesis poliketida dikatalisis oleh Poliketida sintase (PKS). Berdasarkan

jumlah subunit dan mekanisme sintesis, PKS dibagi menjadi tiga tipe, yaitu PKS tipe I, PKS tipe II, dan PKS tipe III. PKS18 dari M. tuberculosis termasuk kedalam PKS tipe III yang mengkatalisis sintesis α-piron. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari struktur dan fungsi PKS tipe III dari dua isolat klinis M. tuberculosis, yaitu isolat L26 dan H37. Hasil amplifikasi open reading frame gen pks18 dari dua galur isolat klinis tersebut diklon ke vektor pGEM-T, disubklon ke vektor ekspresi pET-30a(+), kemudian diekspresikan dalam Escherichia coli BL21(DE3). PKS18 rekombinan dimurnikan dan dikarakterisasi untuk mengetahui kemampuannya dalam mengkatalisis reaksi

sintesis poliketida α-piron. Gen pks18 diamplifikasi menggunakan satu pasang primer yang dirancang berdasarkan gen pks18 pada M. tuberculosis galur H37Rv (GenBank accession no. P9WPFI). Urutan nukleotida primer maju yang digunakan adalah 5'- ggatccATGAACGTCTCAGCTGAGAG-3' dan urutan primer balik yang digunakan adalah 5'-aagcttTCACCGTCGGATGATGTCGA-3'. Amplikon yang berukuran 1,2 kb telah berhasil diklon ke dalam vektor kloning pGEM-T. Amplikon ini kemudian disisipkan pada vektor ekspresi pET-30a(+) menghasilkan plasmid pET-pks18 rekombinan. Analisis pensejajaran urutan nukleotida gen pks18 antara M. tuberculosis galur H37Rv (sebagai galur acuan) dan M. tuberculosis isolat klinis menunjukkan bahwa psk18 dari L26 mempunyai urutan nukleotida yang identik dengan pks18 dari H37Rv, sedangkan pks18 dari H37 memiliki dua mutasi. Mutasi pada pks18 dari H37 adalah C823T dan C1142T yang menghasilkan substitusi asam amino Cys275Arg dan Val381Ala. Kedua perbedaan asam amino ini belum pernah

dilaporkan. Gen pks18 diekspresikan pada E. coli BL21(DE3) dengan menambahkan IPTG sebagai penginduksi. Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa PKS18 dari H37 (PKS18_H37) dan PKS18 dari L26 (PKS18_26) diekspresikan sebagai protein

terlarut dan badan inklusi (agregat) yang berukuran ~48 kDa. SDS-PAGE, intensitas pita protein PKS18_H37 yang berbentuk agregat lebih tinggi daripada PKS18_L26 yang mengindikasikan kelarutan PKS18_H37 lebih kecil daripada

PKS18_L26. Kemampuan PKS18_L26 dan PKS18_H37 dalam mengkatalisis biosintesis poliketida α-piron dipelajari dengan menggunakan malonil-KoA sebagai unit pemanjang dan heksanoil-KoA sebagai starter. Berdasarkan analisis kromatogram KLT, produk hasil katalisis PKS18_L26 mempunyai noda baru yang memiliki nilai Rf lebih tinggi dari malonil-KoA dan heksanoil-KoA, sedangkan pada PKS18_H37 tidak ditemukan adanya noda produk hasil reaksi. Selain itu, kromatogram HPLC hasil sintesis α-piron dari malonil-KoA sebagai starter dan unit pemanjang mengindikasikan PKS18_L26 mampu mengkatalisis

pembentukan poliketida α-piron. Namun, PKS18_H37 tidak dapat mengkatalisis biosintesis poliketida α-piron yang mengindikasikan bahwa PKS18_H37 tidak aktif.

Analisis pemodelan struktur PKS18_L26 menunjukkan bahwa PKS18_L26 memiliki struktur yang sama dengan PKS18_H37Rv. Struktur sekunder pada PKS18_H37 mengalami perubahan akibat dari substitusi Cys275 menjadi Arg275, namun substitusi Val381Ala tidak mempengaruhi struktur. Cys275Arg berada pada saluran pengikat substrat, sehingga perubahan struktur diduga mengakibatkan penyempitan saluran dan menghambat jalan substrat menuju sisi

katalitik. Berdasarkan hasil penelitian ini, ditemukan adanya keterkaitan antara struktur dan fungsi PKS18 pada reaksi biosintesis poliketida α-piron. Oleh karena itu,

diperlukan pengkajian secara mendalam struktur tiga dimensi PKS18_H37, serta mengisolasi α-piron dari isolat klinis M. tuberculosis L26 dan H37 untuk mempelajari fungsi PKS18 secara in vivo. Selain itu, perlu dilakukan kajian PKS18 dari berbagai macam isolat klinis M. tuberculosis untuk dapat mempelajari hubungan pengaruh keberadaan α-piron pada dinding sel dengan sensitivitas isolat klinis terhadap obat.

Deskripsi Alternatif :

Polyketides are secondary metabolites produced by plants, animals, fungi, and bacteria. Polyketide is synthesized through condensation reaction of C2 multiple carbon chain of fatty acid. α-Pyrone is an example of polyketide which is embedded in lipid and glycolipid layer of Mycobacterium tuberculosis cell wall. Polyketide biosynthesis is catalysed by Polyketide synthase (PKS). Based on number of subunits and mode of synthesis, PKSs are divided into three types, namely type I PKS, type II PKS, and type III PKS. PKS18 of M. tuberculosis belongs to a type III PKS which catalyses the synthesis of α-pyrone. This research aimed to study structure and function of type III PKS from two clinical isolates M. tuberculosis. M. tuberculosis clinical isolates used in this study were M. tuberculosis L26 and H37. The PCR amplified pks18 gene M. tuberculosis was first cloned into the pGEM-T vector, subcloned into pET-30a(+) expression vector, and then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant PKS18 was purified and characterized in term of its ability to

catalyse the synthesis of α-pyrone polyketide. The pks18 gene was amplified using a set of primers which were designed based on M. tuberculosis strain H37Rv (GenBank accession no. P9WPFI) in which the sequence of forward primer was 5'-ggatccATGAACGTCTCAGCTGAGAG-3' and the reverse was 5'-aagcttTCACCGTCGGATGATGTCGA-3'. The amplicon

with the size of 1.2 kb was cloned into the pGEM-T vector. This had been inserted into pET-30a(+) expression plasmid generating pET-pks18 recombinant plasmid.

Nucleotide sequence alignment analysis of pks18 among M. tuberculosis strain H37Rv (as a reference strain) and the two M. tuberculosis clinical isolates demonstrated pks18 of L26 was identical with the pks18 of reference strain, while pks18 of H37 has two nucleotide changes. The pks18 of H37 has mutation of C823T and C1142T which results in amino acid substitutions of Cys275Arg and Val381Ala. These types of mutations have never been reported. The pks18 gene were expressed in E. coli strain BL21 (DE3) employing IPTG addition as an inducer. SDS-PAGE analysis showed that the PKS18 from L26 (PKS18_L26) and PKS18 from H37 (PKS18_H37) were both produced as soluble and inclusion bodies (aggregate) with molecular weight of ~48 kDa.

Protein band intensity indicated that the amount inclusion bodies of PKS18_H37 was much higher compared to PKS18_L26 suggesting that the solubility of PKS18_H37 is less than that of PKS18_L26. The abilities of PKS18_L26 and PKS18_H37 in catalysing α-pyrone polyketide biosynthesis were studied using malonyl-CoA as an extender and hexanoyl-CoA as a starter. The expected products were analysed by TLC. TLC chromatogram indicated the product of reaction synthesized by PKS18_L26 was detected as new

spot with Rf higher than both malonyl-CoA and hexanoyl-CoA, whereas no product appeared from reaction by PKS18_H37. Furthermore, action of PKS18 was also performed using malonyl-CoA as a starter and extender. The HPLC

chromatogram of the product indicated that PKS18_L26 was able to catalyse the biosynthesis of α-pyrone polyketide. In contrast, PKS18_H37 has lost its ability to catalyze α-pyrone polyketide biosynthesis indicating that PKS18_H37 is inactive. Protein model structure analysis showed that PKS18_L26 has similar structure as PKS18_H37Rv. On the other hand, PKS18_H37 having substitution of Cys275Arg apparently has altered secondary structure, whereas substitution of Val381Ala in PKS18_37 gave no effect on structure. Since Cys275 is located in substrates binding tunnel, this alteration might cause constriction and in turn would inhibit substrates to reach the catalytic site.

This research clearly indicated the correlation between PKS18 structure and PKS18 function in catalysing α-pyrone polyketide biosynthesis. Therefore, in the future it is important to perform a more thorough study on three dimensional structure of PKS18_H37, to isolate α-pyrone from the two M. tuberculosis clinical isolates to elucidate the function of PKS18 in vivo. The study of PKS18 from various different clinical isolates of M. tuberculosis would also be of interest in order to understand the correlation between the presence of α-pyron in cell wall and drug sensitivity.

Copyrights : Copyright (c) 2001 by Perpustakaan Digital ITB. Verbatim copying and distribution of this entire article is permitted by author in any medium, provided this notice is preserved.

Beri Komentar ?#(0) | Bookmark

PropertiNilai Properti
ID PublisherJBPTITBPP
OrganisasiS3 - Chemistry-FMIPA
Nama KontakUPT Perpustakaan ITB
AlamatJl. Ganesha 10
KotaBandung
DaerahJawa Barat
NegaraIndonesia
Telepon62-22-2509118, 2500089
Fax62-22-2500089
E-mail Administratordigilib@lib.itb.ac.id
E-mail CKOinfo@lib.itb.ac.id

Print ...

Kontributor...

  • Pembimbing :

    Dr. Dessy Natalia.;

    Prof. Dr. Yana Maolana Syah.;

    Dr. Enny Ratnaningsih., Editor: Alice Diniarti

File PDF...