Path: TopS2-ThesesChemistry2012

ISOLASI DAN KARAKTERISASI LIPASE STABIL PELARUT ORGANIK DARI PSEUDOMONAS STUTZERI ISOLAT KAWAH LUMPUR “BLEDUG KUWU” PURWODADI JAWA TENGAH

ISOLATION DAN CHARACTERIZATION OF AN ORGANIC SOLVENT STABLE LIPASE FROM PSEUDOMONAS STUTZERI ISOLATED FROM MUD CRATER “BLEDUG KUWU” PURWODADI CENTRAL JAVA

Master Theses from JBPTITBPP / 2014-03-05 08:04:09
Oleh : I PUTU PARWATA (NIM : 20510029); Pembimbing : Dr. Rukman Hertadi, S2 - Chemistry
Dibuat : 2012, dengan 7 file

Keyword : lipase, stabil pelarut organik, bakteri halofilik

Lipase (triasilgliserol hidrolase, EC 3.1.1.3) adalah enzim yang secara alami mengkatalisis hidrolisis trigliserida dengan rantai karbon panjang yang tidak larut dalam air. Dewasa ini lipase banyak dikembangkan untuk mengkatalisis reaksi sintesis senyawa organik. Untuk itu diperlukan lipase yang memiliki stabilitas terhadap pelarut organik. Lipase yang stabil dalam kondisi ekstrim seperti pelarut









organik umumnya diperoleh dari mikroorganisme yang dapat hidup dalam lingkungan dengan kondisi ekstrim (extremophiles). Salah satunya adalah mikroorganisme halofilik yang dapat hidup dalam lingkungan dengan kadar









garam tinggi (aktivitas air rendah) memiliki potensi menghasilkan lipase yang stabil dalam pelarut organik. Pada penelitian ini mikroorganisme halofilik diisolasi dari sumber air garam kawah lumpur “Bledug Kuwu” yang berlokasi di Desa Kuwu Kecamatan Kradenan, Purwodadi Jawa Tengah. Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh lipase yang stabil terhadap pelarut organik dari mikroorganisme halofilik dari sumber air garam tersebut. Sampel air garam diambil dari tempat penampungan air yang keluar dari letupan kawah lumpur. Mikroorganisme dalam sampel air ditumbuhkan dalam media Luria Bertani (LB) cair dengan komposisi tripton 0,1%, ekstrak ragi 0,05%, NaCl 5%, dan air sampel, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Sebanyak 20 koloni yang tumbuh dipilih secara acak dan diuji toleransinya terhadap kadar NaCl menggunakan media padat dengan komposisi tripton 0,1%, ekstrak ragi 0,05%, bacto agar 2%, dan NaCl (0-30%). Semua koloni kemudian diuji potensi lipolitiknya menggunakan media padat dengan komposisi pepton 0,5%, ekstrak ragi 0,5%, CaCl2 0,05%, NaCl 5%, bacto agar 2%, suspensi substrat (minyak olive 2,5%, tween 80 1,0%), dan indikator warna rhodamin B 2,0%. Koloni yang menunjukkan potensi lipolitik kemudian diisolasi dari campuran menggunakan teknik sebar dan gores empat kuadran. Isolat tunggal yang diperoleh diidentifikasi dengan uji pewarnaan Gram, analisis gen 16s rRNA dan konstruksi pohon









filogenetik. Lipase diproduksi dari isolat tunggal menggunakan media cair dengan komposisi pepton 0,5%, ekstrak yeast 0,5%, CaCl2 0,05%, NaCl 0,1%. Ekstrak









kasar lipase difraksinasi menggunakan aseton dan amonium sulfat secara bertingkat masing-masing dengan tiga fraksi, yaitu 0-40%, 40-60%, dan 60-80%.









Berat molekul lipase ditentukan dengan SDS-PAGE dan zymogram. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan bovin serum albumin (BSA) sebagai standar. Lipase hasil fraksinasi dikarakterisasi berdasarkan









beberapa parameter seperti pH, temperatur, pengaruh ion logam, detergen dan inhibitor, serta efek pelarut organik. Aktivitas lipase diuji menggunakan substrat para nitrofenil palmitat (pNPP) dengan mengukur absorbansi senyawa para









nitrofenol (pNP) yang dihasilkan dari proses katalisis pada panjang gelombang 405 nm. Aktivitas lipase dinyatakan dalam satuan unit/mg, yaitu μmol senyawa pNP (produk) yang dihasilkan oleh lipase per menit per mg enzim.









Hasil penelitian menunjukkan koloni-koloni yang diperoleh sebagian besar dapat hidup pada media dengan kadar NaCl dari 5-27,5%, namun ada tiga koloni yang hanya mampu bertahan hidup pada kadar garam hingga 7,5%. Hasil uji potensi lipolitik menunjukkan ada satu koloni yang positif menghasilkan lipase, dimana koloni ini memiliki toleransi terhadap kadar NaCl dari 0-7,5% (termasuk halofilik









rendah). Isolat tunggal dari koloni tersebut memiliki bentuk batang dan termasuk golongan bakteri gram negatif. Hasil konstruksi pohon filogentik menunjukkan kedekatan isolat dengan Pseudomonas stutzeri. Isolasi dan fraksinasi lipase dari isolat tunggal tersebut memberikan hasil terbaik pada fraksi 40-60% dengan aktivitas spesifik lipase sebesar 10,5 unit/mg untuk fraksinasi dengan aseton dan









12,8 unit/mg untuk fraksinasi menggunakan amonium sulfat. Hasil analisis SDSPAGE dan zymogram menunjukkan lipase yang diperoleh memiliki berat molekul 29 kDa. Lipase menunjukkan aktivitas optimum pada pH 8,5 dan temperatur 50 oC. Lipase masih stabil setelah diinkubasi selama satu jam pada temperatur 40 oC, dan mampu mempertahankan aktivitasnya hingga 74% setelah diinkubasi selama satu jam pada temperatur 50 oC. Aktivitas lipase meningkat dengan kehadiran ionion seperti Zn2+dan Ba2+, namun menurun oleh ion-ion seperti Cu2+ dan Fe2+.









Inhibitor PMSF tidak signifikan menghambat aktivitas lipase yang menunjukkan kemungkinan enzim bukan termasuk golongan serin hidrolase. Lipase mampu mempertahankan aktivitasnya hingga 56% setelah diinkubasi selama 1 jam dalam 50 mM buffer Glisin-NaOH (pH 8,5) yang mengandung 10 mM EDTA,









menunjukkan bahwa lipase tersebut tidak termasuk golongan metallo enzim. Hasil pengujian menunjukkan lipase stabil terhadap beberapa pelarut organik polar seperti methanol, etanol, dan aseton, serta pelarut organik non polar n-heksana, sehingga sangat potensial dikembangkan sebagai biokatalisator dalam reaksi sintesis organik. Dapat disimpulkan penelitian ini telah berhasil memperoleh









varian lipase yang stabil terhadap pelarut organik dari bakteri halofilik yang diisolasi dari kawah lumpur “Bledug Kuwu”.

Deskripsi Alternatif :

Lipase (triacylglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) is an enzyme that catalyze the hydrolysis of water-insoluble long-chain triglicerides. Nowadays lipase has also been applied to catalyze the synthesis of organic compounds. Therefore, it is demanded to have lipase that stable in organic solvents. Lipase that is stable under extreme conditions, such as in high concentration of organic compound, are generally isolated from microorganisms living in extreme environments









(extremophiles). One of them is halophilic microorganisms that can live in environments with high salinity or low water activitythat is similar to the environment with high level of organic compounds. Therefore, it can be expected









that extracellular lipases released from this type of microorganism will also stable in organic solvents. In this study, we cultivated microorganism isolated from salty









water emerge from the mud crater of "Bleduk Kuwu" located in Kuwu Vilage of Grobongan Regency in Central Java. The aim of this work is thus to obtained potential microorganism that can produce organic solvent-stable lipase.









In order to obtain potential microorganism, the salty water from the mud crater were grown at 37oC for 48 hours in liquid Luria Bertani medium (LB) composed of 0.1% tryptone, 0.05% yeast extract, and 5% NaCl. A total of 20 well-grown









colonies were randomly selected and tested for the tolerance to NaCl levels using medium composed of 0.1% tryptone, 0.05% yeast extract, 2% bacto agar, and 0-30% NaCl. All colonies were then examined for lipolytic potency using medium with a composition of 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.05% CaCl2, 5% NaCl, and 2% bacto agar, substrate suspension (2.5% olive oil, 1.0% tween 80), and 2.0% Rhodamin B. Colonies that showed lipolytic activity was isolated from the mixtures using four quadrants spread and strike techniques. A single isolated bacteria was identified using some techniques, i.e. Gram┬ĺs staining, analysis of 16s rRNA gene and construction of phylogenetic tree. Lipase was produced from a single isolate using liquid medium composed of 0.5% peptone, 0.5% yeast









extract, 0.05% CaCl2, and 0.1% NaCl. Lipase crude extract fractionated using acetone and ammonium sulfate in three range of concentrations, i.e. 0-40%, 40-60% and 60-80%. The molecular weight of lipase was estimated by SDS-PAGE









and zymogram. The concentration of protein was determined by Bradford technique using bovin serum albumine (BSA) as the standard. Lipase was characterized biochemically in order to obtain optimum pH and temperature, to study effect of metal ions, detergents and inhibitors, as well as to examine the effects of organic solvents. Lipase activity was measured using the substrate of pnitrophenyl palmitate (pNPP) by measuring the absorbance of p-nitrophenol (pNP) released from the catalytic process at a wavelength of 405 nm. Lipase activity is expressed in units/mg, i.e. μmol of pNP (products) produced by the lipase per minute per mg of enzyme.









The results showed that most of the colonies acquired to grow well in medium with salt concentrations from 5 to 27.5%, but there are only three colonies able to survive in salt levels up to 7.5%. The result of lipolytic potency test showed one colony produce lipase, which has tolerancy to NaCl levels from 0 to 7.5% (belong to moderate halophilic). The morphology of the single isolated colony has bacillus shape and it was belong to a group of gram-negatif bacteria. The phylogenetic analysis showed the bacteria belong to Pseudomonas stutzeri. The best results of lipase fractionation provides at a fraction of 40-60% with specific activity of 10.5 units/mg and 12.8 units/mg for fractionation with acetone and ammonium sulphate, respectively. The results of SDS-PAGE and zymogram showed that the obtained lipase has a molecular weight of 29 kDa. Lipase showed optimum activity at pH 8.5 and temperature 50oC. Lipase was stable after incubation for one hour at a temperature of 40┬░C, and able to maintain its activity up to 74% after incubation for one hour at a temperature of 50oC. Lipase activity increased with the presence of ions such as Zn2+ and Ba2+, but decreased by ions such as









Cu2+ and Fe2+. Inhibitor PMSF did not significantly inhibit the activity of lipase suggesting that the enzyme probably is not included in serine hydrolases group.









Lipase is able to maintain its activity up to 56% after incubation for 1 hour in 50 mM Glicin-NaOH buffer (pH 8.5) containing 10 mM EDTA, which indicates the lipase does not belong to metalloenzymes group. The obtained lipase was also stable against some polar organic solvents such as methanol, ethanol, and acetone, as well as non-polar organic solvent such as n-hexane. Therefore, the obtained









lipase is potential to be applied as a biocatalyst in organic synthesis reactions.









This study thus has successfully to obtain an organic solvent-stable lipase from halophilic bacteria isolated from the mud crater of "Bledug Kuwu”

Beri Komentar ?#(0) | Bookmark

PropertiNilai Properti
ID PublisherJBPTITBPP
OrganisasiS
Nama KontakUPT Perpustakaan ITB
AlamatJl. Ganesha 10
KotaBandung
DaerahJawa Barat
NegaraIndonesia
Telepon62-22-2509118, 2500089
Fax62-22-2500089
E-mail Administratordigilib@lib.itb.ac.id
E-mail CKOinfo@lib.itb.ac.id

Print ...

Kontributor...

  • Pembimbing : Dr. Rukman Hertadi, Editor: Alice Diniarti

Download...