Path: Top S3-Dissertations Chemistry 2017

KARAKTERISASI PERAN AIF MITOKONDRIA DALAM REGULASI KEMATIAN SEL TERPROGRAM YANG DIINDUKSI OLEH MOLEKUL SITOTOKSIK

CHARACTERIZATION OF THE ROLE OF THE MITOCHONDRIAL AIF IN THE REGULATION OF PROGRAMMED CELL DEATH INDUCED BY CYTOTOXIC MOLECULES

PhD Theses from JBPTITBPP / 2017-04-27 14:23:31
Oleh : HESTI LINA WIRASWATI ( NIM: 30511015 ), Department of Chemistry
Dibuat : 2017-03-06, dengan 7 file

Keyword : apoptosis, mitokondria, AIF, menadion

Mitokondria merupakan organel yang memiliki dua fungsi. Pada sel sehat, mitokondria berperan sebagai pabrik energi yang sangat diperlukan bagi kelangsungan hidup sel. Pada beberapa kondisi yang ditimbulkan oleh agen stress, mitokondria mengarahkan sel untuk berada pada fase kematian yang tidak dapat balik. Molekul sitotoksik dapat mempengaruhi kelangsungan hidup sel, tidak hanya memprovokasi terjadinya gangguan fungsi mitokondria, tetapi juga menyebabkan pelepasan protein-protein letal mitokondria ke sitoplasma. Salah satu protein tersebut adalah Apoptosis-Inducing Factor (AIF), yang awalnya diketahui sebagai efektor kematian yang bebas kaspase. Pada sel-sel yang terinduksi untuk mati, melalui permeabilitas membran luar mitokondria, AIF yang semula berada di dalam mitokondria akan bertranslokasi ke sitoplasma, lalu ke inti sel untuk berpartisipasi dalam kondensasi kromatin dan degradasi DNA. Disamping regulasinya dalam kematian sel, AIF memainkan peran vital dalam mitokondria pada sel sehat, yaitu dengan meregulasi aktivitas rantai respirasi. Baru-baru ini diusulkan adanya fungsi tambahan pada AIF (dalam konteks regulasinya pada rantai respirasi), AIF memiliki aktivitas dalam metabolisme senyawa kuinon, salah satunya adalah menadione (2-methyl-1,4-naphtoquinone; vitamin K3), dengan bertindak sebagai NAD(P)H : kuinon reduktase, dengan memfasilitasi reaksi reduksi kuinon menjadi senyawa semikuinon atau hidrokuinon yang bersifat toksik. Reduksi menadion dikaitkan dengan kecepatan siklus redoks yang berkonsekuensi pada terjadinya stress oksidatif di dalam sel. Selain reduksi, menadion bisa melakukan arilasi dengan antioksidan glutation (GSH) dengan membentuk senyawa tiodion yang juga bersifat toksik. Oleh karena itu, memahami metabolisme seluler kuinon merupakan hal penting dalam bidang onkologi karena senyawa kuinon telah berhasil dieksplorasi berkaitan dengan potensi anti kankernya. Selain itu, mempelajari peran kematian AIF mitokondria sangat penting, khususnya berkaitan dengan perkembangan resistensi kanker dan kontribusinya dalam penemuan target terapi baru.Penelitian ini didedikasikan untuk melakukan karakterisasi AIF mitokondria sebagai dampak dari sitotoksisitas salah satu jenis senyawa kuinon, yaitu menadione. Lini sel U2OS yang berasal dari osteosarcoma manusia digunakan sebagai model sel dalam studi ini. Beberapa percobaan yang bersesuaian untuk mempelajari respon sel terhadap menadione telah dilakukan, diantaranya kultur sel mamalia, perlakuan sel dengan obat, dan transfeksi sel dengan siRNA (small interference Ribonucleic Acid). Pendekatan berbasis flow cytometry diterapkan untuk mengamati dan menganalisa perubahan-perubahan yang terjadi pada sel-sel U2OS terhadap induksi menadione. Studi komputasi dilakukan untuk mengevaluasi dan menganalisa interaksi gugus fungsi menadione terhadap residu-residu AIF. Beberapa perangkat lunak digunakan untuk mendukung studi in silico ini diantaranya; penjajaran struktur 3D protein menggunakan program FATCAT dan studi docking menggunakan program AutoDock vina untuk mengevaluasi dan menganalisa peran AIF mitokondria dalam metabolisme menadion.Hasil penelitian menunjukkan bahwa AIF berkontribusi pada kematian sel yang diinduksi oleh menadion, pada kondisi dimana induksi ini tidak menyebabkan hilangnya permeabilitas membran mitokondria atau dengan kata lain AIF melakukan aksi letalnya tetap di dalam mitokondria (tidak dengan menggunakan aktifitas nukleasenya yang menuntutnya untuk keluar dari mitokondria). Tipe kematian sel yang diinduksi oleh menadion adalah apoptosis, dengan jalur kematian bebas kaspase. Pengujian dengan inhibitor kompleks I rantai respirasi (rotenone) mengungkapkan bahwa efek sitoprotektif akibat ketiadaan AIF tidak bergantung pada aktivitas rantai respirasi. Fenomena ini sekaligus mengungkapkan bahwa aksi letal AIF tidak ada kaitannya dengan aksinya sebagai NADH:quinone reduktase. Flow cytometry juga menunjukkan terbentuknya tiodion, yang juga diketahui sebagai peristiwa yang mendahului kematian sel akibat menadion. Teknik siRNA mengungkapkan bahwa tingkat tiodion mengalami penurunan pada sel-sel tanpa AIF. Keterlibatan AIF dalam proses arilasi menadion dikuatkan dengan terjaganya ketinggian tingkat GSH pada sel-sel tanpa AIF. Semua hasil ini mengungkapkan bahwa AIF berperan dalam memfasilitasi toksisitas menadion, lebih spesifiknya dengan meningkatkan arilasi protein sel dan penurunan tingkat GSH. Studi komputasi mengkonfirmasi keterlibatan AIF pada kematian sel, dengan mengungkapkan kestabilan interaksi AIF-menadione yang lebih tinggi 20% dibandingkan dengan NQO1-menadione (enzim mitokondria yang terlibat dalam reduksi dua-elektron senyawa golongan kuinon). Hasil penjajaran struktur AIF dengan enzim transferase GST (glutation-S-transferase) menunjukkan bahwa AIF tidak memiliki residu katalitik transferase. Analisa energi afinitas mengungkapkan bahwa tiodion memiliki afinitas dengan AIF lebih baik dibandingkan prekursornya; menadione atau GSH. Lebih lagi, meskipun jumlah residu pengenal tiodion sampai 45 % lebih tinggi dibandingkan dengan prekursornya, lebih dari setengah struktur tiodion tidak berhimpit dengan FAD, bahkan menjauhi struktur AIF. Sementara itu struktur menadione/GSH posisinya berhimpitan dg FAD dan bahkan terkubur di dalam struktur AIF. Hal ini semakin menguatkan kesimpulan bahwa AIF memfasilitasi proses arilasi menadion dengan melakukan stabilisasi tiodione, bukan dengan berinteraksi dengan menadion atau GSH secara langsung.

Deskripsi Alternatif :

While in healthy cells, through the activity of its respiratory chain, the mitochondrion acts as an energy factory and is necessary for cell survival, it is established that in various conditions of stress stimuli, this organelle plays an important role in the cellular response to death decision. Cytotoxic molecules can affect cell survival by not only provoking the disruption of vital mitochondrial functions but also by causing the release of mitochondrial proteins into the cytoplasm. The lethal action of those proteins can take the cell to the irreversible phase of death. One of these proteins is AIF (Apoptosis-Inducing Factor) that was initially as caspase-independent death. In cells induced to die, upon mitochondrial outer membrane permeabilization, AIF is translocated to the nucleus, where it fulfills its lethal action by participating to the chromatine condensation and degradation. AIF plays also an indispensible role in the mitochondrion of the healthy cell by regulating the activity of the respiratory chain. Recently, it was proposed that in addition to the regulation of the respiratory chain machinery, the mitochondrial activity of AIF could also be implicated in the reduction of molecules belonging to the quinones family by acting as a NADPH:quinone reductase (such as menadione, 2-methyl-1,4-naphtoquinone), facilitated the formation of semiquinone radical or hydroquinone that associated with rapid redox cycling to lead oxidative stress in the cell. Menadione cytotoxicity also associated with its arylation capacity with an important thiol proteins to form menadione-S-conjugate compound that toxic to the cell. As the cellular reduction and metabolization of quinones is established to be an important prerequisite for their cytotoxicity, understanding their cellular metabolization is of great importance in the field of oncology because members of this family have been successfully explored for their anti-tumor activity. Moreover, study the role of mitochondrial AIF is important, especially related to the development of cancer resistance and could contribute for finding a new cancer therapies aimed and targeting AIF. The research program was dedicated to the characterization of the impact of the mitochondrial activity of AIF on the cytotoxicity of menadione, a compound that belongs to the quinone family. The U2OS cell line used as model for the study was derived from a human osteosarcoma. Mammalian cell culture, drug treatment, and transfection experiments with siRNA (small interference Ribonucleic acid) were employed in order to study the cell respons to drug. Flow cytometry-based approaches were applied in order to study the cytotoxic effects of menadione on U2OS cells. Computational approaches were applied to evaluate and analysis the interaction of functional groups of menadione to AIF residues. Structural alignment was employed using FATCAT software. Molecular docking studies were performed by AutoDock Vina software in order to evaluate and analyze the role of mitochondrial AIF to menadione metabolism. The result showed the contribution of AIF to cell death induced by menadione, in condition this drug does not cause the loss of mitochondrial membrane permeabilization (MMP). It indicates that AIF stays in mitochondria to act its lethal activity and does not use its nuclease apoptotic function. Type of death by menadione induction is apoptosis in caspase-independent manner. Inhibition of Complex I of respiratory chain revealed that the cytoprotective effect of AIF depletion is independent-respiratory chain activity. It also suggests that the lethal action of AIF is not related to NADH:quinone reductase activity. Flow cytometry analysis showed the appearance of tiodione formation that also early event of cell death induced by menadione. siRNA technique also showed that AIF depletion reduced thiodione formation. This cytoprotective effect was accompanied by the maintenance of high levels of reduced gluthatione (GSH), which are normally depleted by menadione. Altogether, these results revealed that AIF facilitate menadione toxicity, thereby precipitating protein arylation and gluthatione depletion. Finally, computational study confirmed the involvement of AIF in menadione-induced death that showed AIF-menadione has interaction stability 20% higher than NQO1-menadione (enzyme that responsible to complete reduction of quinone). Structural alignment between AIF and Gluthatione-S-transferase (GST) showed that AIF does not have transferase catalytic residues. Binding energy analysis showed that thiodione has better affinity to AIF compare to GSH or menadione. Although the number of contact residues that surrounds thiodione is 45% higher compare to menadione or GSH, more than half of thiodione structure is not in frame of FAD position, even being outside the AIF. Meanwhile the structure of menadione and GSH is in frame of FAD position and were buried inside FAD domain of AIF. It indicated that AIF modulates conjugation process by means of stabilizing thiodione formation rather than interact with menadione or GSH directly.

Beri Komentar ?#(0) | Bookmark

PropertiNilai Properti
ID PublisherJBPTITBPP
OrganisasiDepartment of Chemistry
Nama KontakUPT Perpustakaan ITB
AlamatJl. Ganesha 10
KotaBandung
DaerahJawa Barat
NegaraIndonesia
Telepon62-22-2509118, 2500089
Fax62-22-2500089
E-mail Administratordigilib@lib.itb.ac.id
E-mail CKOinfo@lib.itb.ac.id

Print ...

Kontributor...

  • Pembimbing 1 : Prof. Fida M. Warganegara, Ph.D












    Pembimbing 2 : Prof. Akhmaloka, Ph.D, Editor: Latifa Noor

Download...