Path: Top > S2-Theses > Pharmacy-SF > 2017

Konstruksi Plasmid Sintetik pGroElDnak Untuk Meningkatkan Kelarutan HBcAg Rekombinan sebagai Komponen Vaksin Terapi pada Escherichia coli BL21(DE3)

Master Theses from JBPTITBPP / 2017-10-02 11:19:15
Oleh : FUSVITA MERDEKAWATI (NIM : 20715032), Central Library Institute Technology Bandung
Dibuat : 2017-10-02, dengan 1 file

Keyword : HBcAg, konstruksi, optimasi overproduksi, sistem ko-ekspresi, vaksin terapi

Hepatitis B merupakan penyakit hati yang paling umum terjadi di dunia. Penyakit yang disebabkan oleh virus hepatitis B (VHB) dapat berkembang menjadi sirosis dan karsinoma hati. Desain vaksin terapi dikembangkan untuk mengeliminasi VHB dari tubuh pasien. Salah satu komponen vaksin terapi yang dikembangkan adalah protein inti VHB, hepatitis B core antigen (HBcAg), yang dapat menginduksi sel T sitotoksik spesifik. Overproduksi DNA pengkode HBcAg telah dilakukan pada penelitian sebelumnya menggunakan vektor ekspresi pET28a(+) pada Escherichia coli BL21(DE3). Menggunakan sistem tersebut, HBcAg terlarut diproduksi dengan tingkat rendah yaitu 22,3%. Salah satu strategi untuk meningkatkan kelarutan HBcAg adalah dengan sistem ko-ekspresi dengan gen chaperon GroEl dan DnaK. Konstruksi plasmid pGroElDnaK dilakukan dengan perancangan plasmid yang diikuti dengan sintesis secara kimia, kemudian E. coli BL21(DE3) yang membawa pET28a(+)_HBcAg ditransformasi dengan pGroElDnaK dan transforman dikarakterisasi dengan analisis migrasi dan pemotongan. Optimasi overproduksi HBcAg pada skala 200 mL dilakukan pada dua suhu dan dua jenis media pertumbuhan. HBcAg juga diproduksi dalam fermentor 1 Liter menggunakan kondisi optimum dan dimurnikan dengan kromatografi penukar kation. Penentuan tingkat produksi dan kemurnian HBcAg dilakukan menggunakan analisis SDS-PAGE 15%. Persentase HBcAg larut terhadap protein intrasel dihitung menggunakan perangkat lunak ImageJ. Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan keberadaan pita protein berukuran 21,1 kDa pada fraksi terlarut yang sesuai dengan ukuran teoritis HBcAg, 21 kDa. Pada skala 200 mL, ko-ekspresi dengan gen pengkode chaperon GroElDnaK meningkatkan HBcAg terlarut hingga 100% pada suhu induksi 25°C dan 37°C. Kondisi optimum untuk ekspresi protein HBcAg diperoleh pada suhu induksi 25°C pada media LB dengan persentase HBcAg terhadap protein total sebesar 0,87%. Protein HBcAg dapat diproduksi pada fermentor 1 L dengan HBcAg terlarut mencapai 100% dan pemurnian dengan kromatografi penukar kation belum menghasilkan HBcAg dengan kemurnian tinggi.

Deskripsi Alternatif :

Hepatitis B is the most common liver disease in the world. Diseases caused by hepatitis B virus (HBV) could develop into cirrhosis and liver carcinoma. The therapeutic vaccine design was developed to eliminate HBV from the patient's body. One component of the therapeutic vaccines developed is the core protein of HBV, hepatitis B core antigen (HBcAg) that could induce specific cytotoxic T cells. Overexpression of the DNA encoding HBcAg had been performed in previous studies using a pET28a(+) expression vector in Escherichia coli BL21(DE3). Using the system, dissolved HBcAg was produced at a low level of 22.3%. One strategy to increase HBcAg solubility is by co-expression system with GroEl and DnaK chaperon genes. Construction of pGroElDnaK plasmid was conducted by plasmid design followed by chemical synthesis, then E. coli BL21(DE3) carrying pET28a(+)_HBcAg was transformed by pGroElDnaK and transformants were characterized by migration and restriction analysis. The optimization of HBcAg overproduction at a 200-mL scale was performed at two temperatures and two growth media types. HBcAg was also produced in a 1 Liter fermenter using optimum conditions and purified by cation exchange chromatography. Determination of production level and purity of HBcAg was performed using a 15% SDS-PAGE analysis. The percentage of soluble HBcAg to intracellular protein was calculated using ImageJ software. Results of SDS-PAGE analysis showed the presence of a 21.1 kDa protein band in the dissolved fraction corresponding to the theoretical size of HBcAg, 21 kDa. At a 200-mL scale, co-expression with the genes encoding chaperon GroElDnaK increased dissolved HBcAg by 100% at the induction temperature of 25°C and 37°C. The optimum conditions for HBcAg protein expression were obtained at induction temperature of 25°C in LB medium with HBcAg percentage of total protein of 0.87%. HBcAg protein could be produced in 1 L fermenter with 100% dissolved HBcAg and purification by cation exchange chromatography did not yield HBcAg with high purity.

Copyrights : Copyright (c) 2001 by Perpustakaan Digital ITB. Verbatim copying and distribution of this entire article is permitted by author in any medium, provided this notice is preserved.

Beri Komentar ?#(0) | Bookmark

PropertiNilai Properti
ID PublisherJBPTITBPP
OrganisasiC
Nama KontakUPT Perpustakaan ITB
AlamatJl. Ganesha 10
KotaBandung
DaerahJawa Barat
NegaraIndonesia
Telepon62-22-2509118, 2500089
Fax62-22-2500089
E-mail Administratordigilib@lib.itb.ac.id
E-mail CKOinfo@lib.itb.ac.id

Print ...

Kontributor...

  • PEMBIMBING : Dr. Debbie S. Retnoningrum Dr. Ernawati A. Giri-Rachman, Editor: yana mulyana

File PDF...